原文出处

ChakravartiD,HuBL,MaoXZ,RashidA,etal.TelomeredysfunctionactivatesYAP1todrivetissueinflammation.NatCommun.;11:

研究背景

端粒是染色体末端的一段重复的核酸和染色质结构，其长度主要由端粒酶维持。端粒酶由端粒酶逆转录酶（TERT）和RNA组分（TERC）两部分组成。有研究显示，端粒维持缺陷可导致人类慢性炎症性疾病的患病风险增加，但端粒功能障碍是否可以直接导致炎症出现或者通过产生活性氧（ROS）进而导致炎症发生尚不清楚。

在敲除mTerc的小鼠中，端粒功能障碍通过促进CCL4诱导的肝损伤进而导致肝炎和肝硬化。而在人类中，TERC或TERT种系突变的人类可发展为特发性肺纤维化，此外还可改变病毒性肝炎患者肝脏细胞的转归，导致出现肝脏炎症以及肝硬化的发生。人体中端粒酶组分种系突变可导致肠道进行性绒毛萎缩、结肠炎和上皮内淋巴细胞增多症。炎症性肠病（IBD）患者中肠上皮细胞端粒缩短的情况增加，并提高结肠癌的发病风险。但目前为止，端粒功能障碍如何导致肠道炎症尚不清楚，而针对该问题的研究将对端粒受损相关的其他炎症性疾病的发病机制研究提供一定的参考。有研究表明，短端粒可以激活cGAS/STING途径，进而导致细胞自噬增加，大量细胞死亡，这表明端粒功能障碍可能在炎症的发生发展中起到重要的作用。

本文中，作者在端粒功能紊乱的老鼠肠道中发现了结肠的节段性功能紊乱，提示端粒功能障碍可能是一种促进炎症发生的新途径。

研究结果

结果一：肠上皮细胞端粒功能障碍导致炎症发生

作者首先构建了一种端粒功能障碍的小鼠模型，该模型小鼠基因携带一个Lgr5启动子（Lgr5-GFP-IRES-CreERT2），该启动子可以使Lgr5阳性的上皮细胞表达GFP、CreERT2、以及一个mTert等位基因（LSLmTert），该基因可以通过Cre介导的转录子缺失而重新激活LoxP位点。纯合子LSL-mTert小鼠之间的代际杂交将导致小鼠体内端粒逐渐丢失，在第3代（G3）和第4代（G4）时小鼠将出现DNA损伤，导致组织干细胞耗竭、器官萎缩和早衰。在实验设计中，G0小鼠为具有端粒酶活性的对照组。

作者分别选取3个月大的G0和G4小鼠（幼崽）进行肠道组织学分析，结果显示，约有40%的G4小鼠出现轻微的结肠退化，表现为隐窝炎和隐窝脓肿、轻微炎症和DNA损伤（补充表1；补充图1a和2g），而回肠末端仅有轻度阴我炎症（补充图1d）。而在8个月时的老年小鼠中，G0小鼠肠道的病理改变较轻，而G4小鼠结肠出现多出糜烂和溃疡，伴有明显的隐窝炎和隐窝脓肿以及慢性炎性改变（图1a；补充表1；补充图1f），并且肠道上皮DNA损伤增加，小鼠体重明显下降（图1d）。此外，G4小鼠末端出现中度病理改变，十二指肠和空场结构正常（补充图1e）。老年G4小鼠肠道的免疫表达谱显示，肠道中CD4+和CD8+T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞含量丰富（图1f–i；补充图2h–k），这与先前的研究结果一致，即T细胞是炎性病理改变的主要驱动因素。与同年龄的小鼠相比，G4幼崽小鼠肠道固有层中CD4+和CD8+T细胞的浸润程度较高，淋巴细胞（CD45+细胞）数量较少，但是理学评分结果显示，G4幼崽肠道结构完整，具有较低的病理组织学评分（补充图2l-o）。因此，作者推测G4小鼠上皮细胞中存在内源性DNA损伤信号导致促炎因子的分泌，招募T细胞进而诱发组织炎症。

端粒功能障碍对全身所有器官均可造成影响，因此作者想要明确是否端粒功能障碍可以对肠上皮产生特异性的影响，进而直接引起炎症性改变。在作者构建的小鼠模型中，TAM处理后，Cre介导LSL基因序列丢失并激活Tert的表达。作者选取G0+TAM小鼠处理组作为端粒功能正常的对照组，选取1月龄幼崽和6月龄的老年小鼠给予TAM处理，结果发现，γH2AX在肠上皮中的表达增加，端粒酶重新激活，端粒结构重建（图1b，c老年小鼠；补充图2b，f，g小鼠幼崽）。对G4老年小鼠进行TAM处理30天后，约有50%的小鼠隐窝炎、隐窝脓肿和炎症改变明显减轻（补充图1g，i），60天后仅有33%的小鼠出现肠上皮增生、隐窝炎、隐窝脓肿和中重度炎症（图1a；补充图1g–i）。与G4对照组相比，老年G4+TAM小鼠体重恢复正常，总体存活率增加（G4+TAM小鼠的中位生存期增加了20.4周）（图1d，e）。流式细胞学检测结果显示G4+TAM老年小鼠和小鼠幼崽肠道T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞数量明显减少。这些数据表明，肠上皮细胞的端粒功能障碍可以诱发并维持炎症性病理改变，而恢复端粒功能可改善肠道炎症。

为在人类样本中进行验证，作者获取并分析医院21例端粒功能障碍患者的数据，这些患者最后随访或死亡的平均年龄为12岁，作者获取了8例出现胃肠道症状的患者的活检标本。与临床资料一致，8例患者中有5例出现肠道炎症症状（图1j），包括急性肠炎或结肠炎，伴，肠上皮固有层出现慢性炎症特异的嗜酸性粒细胞浸润、隐窝凋亡水平增加、隐窝炎、局灶性腺体损伤、轻度淋巴细胞浸润伴轻度隐窝增生以及明显的上皮内T细胞浸润（图1j）。与年龄匹配的正常对照组相比，在这些患者样本中DNA损伤信号（γH2AX）水平较高（图1k，l）。这些数据表明，端粒功能障碍是炎症的驱动因素。

Figure1

结果二：YAP1是介导IL-18参与的免疫途径的关键调控因子

为明确肠上皮炎症的主要驱动因素，作者选取3月龄（幼年）G0、G4和G4+TAM小鼠结肠上皮隐窝组织进行了RNA-seq分析。基因集富集分析（GSEA）显示，端粒功能障碍与先天免疫途径（如IFNα、IFNγ途径及补体途径）的过度表达相关（图2a，b；p=0.；富集分数=0.62）。对G0和G4小鼠幼崽结肠中Lgr5GFP+干细胞/祖细胞的差异基因表达分析结果显示，差异基因富集最为明显的是炎性小体途径（图2c，2d）。

作者对炎性小体途径相关的下游分子包括caspase1前体、IL-1β和IL18的水平进行了检测。细胞因子array结果显示，G4小鼠幼崽结肠上皮中IL-1α、IL-1ra、TNF-α和IFN-γ表达水平增高。ELISA和免疫组化结果显示，IL18的水平增高，并且在端粒酶重新激活的G4+TAM小鼠中，IL-18含量下降（图2e）。caspase-1可将pro-IL-18裂解为成熟分泌型IL-18，因此作者并记录了端粒功能障碍小鼠上皮细胞中活化的caspase-1（用p20的裂解来反应其活性）以及成熟型IL-18的含量，结果显示在端粒酶活化后二者表达降低，表明炎性小体途径激活水平下降（图2f）。

IL18是包括溃疡性结肠炎在内的多种炎性疾病中已知的T细胞募集因子。为证实肠上皮是IL18的关键来源，作者对幼年G4小鼠肠上皮细胞中IL-18的水平进行了检测，结果显示，在端粒功能障碍小鼠肠上皮细胞中的pro-IL-18表达增加，TAM处理后激活端粒酶导致其表达降低，γH2AX信号消失（图2g，h），而pro-IL-1β含量无变化，并且几乎没有pro-IL-18和IL-18的表达（图2g）。

为确定引起pro-IL-18上调的转录因子以及炎性小体受体如Nlrp1b、Nlrc4和Nlrp6，作者进行了TRANSFAC启动子分析，并确定了几个保守的可结合序列，包括NFATc1、HNF4a、NKKX2.3、IRF4/9和TEF。YAP1是一种可与TEF结合的转录活化因子，其Y处可被经典DNA损伤信号分子ATM和c-ABL27,28磷酸化，导致YAP1进入细胞核并稳定表达。已知急性DNA损伤诱导的YAP1激活可导致细胞死亡，而YAP1激活在端粒功能障碍引起的衰老和炎症等慢性DNA损伤中的作用尚不清楚。RNAseq结果显示，在G4小鼠肠上皮中存在YAP1信号激活（标准化富集分数NES=1.36，p=0.）（图2i）。

为探究YAP1在免疫途径调节中的作用，作者对G0（端粒完整）和G3（端粒功能障碍）小鼠结肠隐窝组织进行了ChIP-seq分析，发现了个重叠的可与YAP1结合的基因（图2j），并且在端粒功能障碍小鼠上皮细胞中可与YAP1基因启动子结合的基因数占比较高，这与端粒功能障碍表型小鼠中YAP1的高表达量和高稳定性是一致的。GSEA通路分析结果显示，NF-κB介导的TNF-α信号通路是G3上皮中最重要的通路，且在显著性最高的10条通路中还包括与p53和凋亡相关的其它通路（图2k）。此外，作者发现在G3和G0小鼠上皮细胞中，在NLRP1B、NLRP6、NLRC4以及IL-18基因启动子处YAP1结合率较高（图2l）。YAP1Ch-IP实验结果也显示，与G0对照组相比，G3小鼠肠组织中YAP1与pro-IL-18启动子区结合能力增强，而在G3+TAM样品中结合能力降低（图2m）。这些数据均表明YAP1在端粒功能障碍的炎症驱动中具有重要作用。

Figure2

结果三：端粒功能障碍激活YAP1

在作者构建的端粒功能失调小鼠模型肠道中，磷酸化ATM、CHK2和YAP1（Y）的表达水平较高，并且在重新激活端粒酶时这些分子的表达水平降低（图3a）。虽然NF-κB是许多炎症基因的主要转录调控因子，但我们在这些样本中并未发现NF-κB通路相关因子（pNFκB、IκB和pIκB）磷酸化水平的改变（图3a）。在G4小鼠肠道中结肠隐窝干细胞和祖细胞的细胞核中检测较高水平的YAP1（图3b），且YAP1核定位信号在端粒酶重新激活时减弱（图3b）。患者活检结果显示YAP1稳定表达，结肠上皮细胞中IL-18水平较高（图3c，d）。这些数据进一步说明端粒功能障碍可激活YAP1途径促进炎症发生。

炎症小体激活是诱导procaspase-1至caspase-1断裂的关键协同因子，其激活后可使pro-IL-18切割为成熟的IL-18。研究表明，IL-18、Nlrc4、Nlrp1b和Nlrp6及其他几个炎性小体基因是YAP1的靶点。作者检测了能够组装炎症小体的关键微生物受体的表达。在作者构建的模型中，关键炎症蛋白（Nlrp1b、Nlrp3、Nlrc4和Nlrp6）在端粒功能失调的肠道组织中表达量增加，并在端粒酶重新激活时下降。而YAP1-shRNA处理的G4肠道中微生物受体的表达减少。在YAP1激活的肠内也观察到微生物受体和炎性小体通路基因NLRP1b、NLRP3、NLRC4和NLRP6的表达增加。

在转基因小鼠中诱导表达Yap1基因后，小鼠肠道内pro-IL-18、Vgll3、Ankrd1和Cyr61（YAP1的直接靶点）水平明显增高（图3e），而利用shRNA敲低YAP1表达的端粒功能障碍模式肠道类器官中pro-IL-18的表达明显下降（图3f，g）。

作者选取永生化结肠组织细胞系CRL作为研究对象，并在其中敲低端粒酶主要成分TRF2，结果显示，pγH2AX、pATM、pYAP1（Y）和pro-IL-18水平明显增加（图3h）。对质膜分离后细胞蛋白含量的检测结果显示，pYAP1（Y）的核内表达明显增加（图3i）。此外，对小鼠进行中等强度的电离辐射（IR2Gy/天持续5天）后，结肠隐窝上皮中YAP1的核内表达明显升高（图3j），并且pYAP1（Y）水平明显增高（图3k），并且在肠道因我组织中pro-IL-18的mRNA水平明显增高（图3l），Nlrp1b、Nlrp3、Nlrc4和Nlrp6的mRNA水平也有所升高。这些数据表明，端粒处的DNA损伤可以稳定和激活YAP1，同时YAP1可提高关键的炎性基因的转录和pro-IL-18的表达水平。

Figure3

结果四：抑制ATM和YAP1可减少IL-18的分泌改善炎症

为验证ATM-YAP1信号在调节pro-IL-18表达和功能中的作用，作者用ATM抑制剂（0.1μM×24h）或YAP1抑制剂（4μM×24h）分别处理G4小鼠肠道类器官，并对pro-IL-18的水平进行检测。结果显示，两种抑制剂对细胞活性没有明显影响（用caspase3剪切体含量反映细胞活性），但是pYAP1（Y）和pro-IL-18的表达明显降低，表明在端粒功能障碍的G4肠道类器官中ATM和YAP1激活，并可促进pro-IL-18的转录（图4a，b）。

由于结肠上皮中IL-18的分泌增加可对肠道造成损伤并导致炎症，因此作者推测通过抑制IL-18上游信号分子来降低IL-18水平可能成为一种新的治疗策略（图4c）。作者用YAP1抑制剂维替泊芬或caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk分别处理3月龄的G4小鼠，结果显示，与年龄匹配的对照组相比小鼠肠道炎症明显减轻（图4d，e），肠上皮细胞中IL-18表达减少（图4f，g），IFN-γ表达含量降低。并且小鼠体内YAP1和pYAP1（Y）水平明显降低，pro-IL-18和成熟IL-18水平明显降低（图4g）。此外，在维替泊芬治疗组中还观察到procaspase-1剪切体含量减少，表明YAP1可通过转录调控参与炎症小体组装和procaspase-1剪切促进炎症小体的激活（图4g）。

肠道菌群可以介导上皮细胞与免疫细胞相互作用，并诱导caspase-1切割，因此在肠道炎症中具有重要的作用。在研究中作者发现，G4小鼠结肠内的病变较小肠相比更为严重，这可能与小肠中较少的菌群数目有关。G0和G4小鼠的肠道菌群组成差异较小。为明确肠道菌群作为诱导IBD中端粒功能障碍的潜在协同因子，作者在小鼠的饮用水中加入广谱抗生素（甲氧苄啶-磺胺甲恶唑）以清楚肠道菌群。结肠镜检查为肠上皮溃疡的G4小鼠用抗生素喂养一个月后，其炎症病理改变明显减轻，pro-IL-18、成熟IL-18、caspase-1剪切体以及IFN-γ的分泌量明显减少。这些数据表明，端粒功能障碍可导致YAP1磷酸化和转录激活，同时肠道菌群促进caspase-1切割导致成熟IL-18含量升高，募集IFNγ分泌型T细胞浸润，诱发肠道炎症。

Figure4

研究结论

1.端粒功能障碍诱导的上皮细胞ATM-YAP1-pro-IL-18通路激活是炎症的关键诱因。

2.端粒功能障碍导致pATM/c-ABL介导的YAP1转录因子激活，上调主要促炎因子pro-IL-18的表达。

3.结肠菌群刺激胞浆受体激活caspase-1，caspase-1将前IL-18裂解为成熟的IL-18，募集可分泌IFN-γ的T细胞并导致肠道炎症。

4.种系端粒维持缺陷患者中DNA损伤（γH2AX）信号以及YAP1和IL-18表达水平增高。

5.在端粒功能紊乱的小鼠中，重新激活肠上皮细胞端粒酶或抑制ATM、YAP1或caspase-1以及抗生素治疗，可显著降低IL-18含量，改善肠道炎症。

校对：刘斌

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