摘要：目的探讨低聚葡萄籽原花青素（GSPE）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）的影响及作用机制。方法将SPF级C57小鼠随机分为对照组、模型组、阳性药组（柳氮磺吡啶组）及GSPE低、中、高剂量（、、mg/kg）组，对照组给予正常饮用水，其他组均自由饮用3%DSS水溶液，连续饮用7d，诱导小鼠UC模型，每天记录小鼠体质量、便血、便型等症状变化，药物干预治疗7d后断头取血，收集结肠和脾脏，记录结肠长度、脾脏质量变化情况。HE染色评估小鼠结肠黏膜组织病理变化，ELISA法检测血清和结肠组织中炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及细胞因子一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，免疫组化分析结肠组织上皮细胞中血红素加氧酶-1（HO-1）、核转录因子-κB（NF-κB）、转录因子E2相关因子2（Nrf2）及Keap-1蛋白表达水平。结果与模型组比较，GSPE中、高剂量组小鼠体质量下降相对缓慢，小鼠腹泻、便血症状改善明显；给药后小鼠血清及结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、MDA水平较模型组显著降低，SOD水平则显著升高（P＜0.01）；病理组织切片分析发现，GSPE高剂量组小鼠结肠黏膜病理损伤显著降低。免疫组化分析结果显示GSPE低、中、高剂量可显著降低NF-κB及Keap-1蛋白表达水平，升高Nrf2、HO-1蛋白表达水平（P＜0.01）。结论GSPE能够有效改善DSS诱导的UC症状，通过调节氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1和炎症通路蛋白NF-κB的表达，进而影响氧化应激指标SOD、MDA和炎症因子的变化，降低结肠组织的病理损伤，对UC的治疗与预防具有重要的价值。

溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）是一种发病机制尚不明确，主要以腹痛、腹泻、血便等为主要临床表现的慢性非特异性免疫性炎性肠病[1]。疾病发展后期会波及大段肠腔，引发中毒性结肠炎以及结肠癌[2]，还有可能发生肠外并发症[3]，临床治愈率低。目前临床上治疗UC主要以糖皮质激素、生物制剂和免疫抑制剂为主，这些药物会对肝脏、神经系统产生毒副作用，且会使病情反复导致恶化[4]。研究发现中药、复方中药及天然药物治疗UC效果显著，不良反应较少，复发率较低[5-6]。因此，开发疗效确切、毒副作用小的天然药物作为临床替代用药已成为目前研究的热点[7]。

原花青素属于缩合鞣质，广泛存在于葡萄籽、花生、高粱、苹果等植物中，尤以葡萄籽中含量最为丰富。原花青素是含有双黄酮衍生物的天然多酚化合物总称，是由不同数量的儿茶素、表儿茶素或没食子酸经C4-C6或C4-C8键合而成。根据聚合度的不同将2～4聚体称为低聚体，5聚体以上称为高聚体[8]。本研究使用低聚葡萄籽原花青素（GSPE）是从葡萄籽中提取出来的多酚类化合物，有研究表明葡萄籽原花青素具有强的抗氧化、清除自由基及抗炎作用[9-10]。对治疗心脑血管疾病、眼科疾病、提高抗体免疫力有明显的效果[11]。但其对治疗UC的报道较少，有研究表明葡萄籽原花青素对胃肠道损伤有一定的保护作用[12-15]。本实验旨在探究不同剂量的GSPE素对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的UC的治疗效果及其作用机制，为开发有效的天然药物提供理论依据。

1材料

1.1仪器

HR低温离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；InfiniteF50全波长酶标仪（德国Tecan公司）；F6/10实验室超细匀浆机（上海弗鲁克科技发展有限公司）；DZKW-D-2电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；MX-4A微孔板震荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；Mini-6K低速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；超低温冰箱（日本Sanyo公司）；BX53奥林巴斯正置显微镜（上海奥林巴斯有限公司）；Leica石蜡切片机（上海莱卡仪器有限公司）。

1.2药品与试剂

DSS（批号Q，美国MPBIO生物医学公司）；GSPE（批号-，儿茶素质量分数22.6%，表儿茶素质量分数18.9%，原花青素B1质量分数4.9%，原花青素B2质量分数3.6%，原花青素B4质量分数1.1%，天津尖峰天然产物研究开发有限公司）；柳氮磺吡啶肠溶片（批号25，上海福达制药有限公司）；4%多聚甲醛（天津百倍生物科技有限公司）；0.9%NaCl溶液（山东科伦药业有公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物医学工程研究所）；一氧化氮试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6试剂盒（北京四柏生物科技有限公司）；血红素加氧酶-1（HO-1）、核转录因子-κB（NF-κB）、转录因子E2相关因子2（Nrf2）、Keap-1抗体（美国CellSignaling公司）。

1.3动物

SPF级C57小鼠，42只，雄性，8周龄，体质量20～22g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供并饲养，许可证号SCXK（京）-，动物合格证号111；动物饲养于干净舒适的环境，温度（22±2）℃，湿度（60±5）%。

2方法

2.1分组、给药方法及UC模型的制备

将42只SPF级C57小鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组（柳氮磺吡啶组）及GSPE低、中、高剂量（、、mg/kg）组，每组7只。各组小鼠适应性喂养1周后，对照组给予正常饮用水，其余各组给予含有3%DSS的饮用水，自由饮用7d，诱导小鼠UC模型。造模第1天开始ig给药，对照组及模型组每日给予等体积蒸馏水，其他各组每日定时给药10mL/kg，连续给药7d。给药后在每日同一时间观察并记录所有小鼠的一般情况、体质量变化、大便性状、大便隐血情况、是否血便及便血程度，初步判断造模及给药效果。

2.2样本采集及处理

连续给药至第7天后小鼠禁食不禁水24h，第8天断头处死取血，随即解剖取脾脏和结肠肠段样本。全血样本于4℃、00r/min离心10min取血清，?80℃保存。脾脏用生理盐水洗净表面血液，吸水纸吸干后称定质量。结肠肠段铺平测量长度，取1cm结肠放入10倍体积的4%多聚甲醛溶液中，室温静置24h进行固定。另取1cm结肠组织，剪开，生理盐水清洗干净，置于EP管中剪碎，加入5倍体积生理盐水进行匀浆，静置2h后在4℃以00r/min离心10min，取上清液，?80℃保存。

2.3血清及结肠组织中细胞因子及炎症因子检测

取低温保存的血清及结肠组织匀浆上清液快速复苏，按ELISA试剂盒方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、SOD、MDA水平。

2.4结肠组织HE染色病理形态学分析

4%多聚甲醛固定保存的结肠组织，常规石蜡切片，苏木精（HE）染色，光学显微镜下观察各组小鼠结肠的形态学变化。参照Wirtz等[16]方法对结肠损伤程度进行半定量评分。

2.5免疫组化检测结肠组织中相关蛋白的表达

4%多聚甲醛固定保存的结肠组织，常规石蜡切片，进行免疫组化NF-κB、Nrf2、HO-1、Keap-1蛋白染色，采用ImageJ软件分析染色结果，倍视野进行拍照，对各蛋白表达量进行半定量分析。

2.6统计学处理

正态性分布数据用表示。采用SPSS13.0统计软件分析数据，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验及Dunnett-t检验。

3结果

3.1GSPE对DSS诱导的UC小鼠一般情况的影响

观察结果显示，对照组小鼠活动状态良好，体质量无下降、毛发光滑有光泽；模型组小鼠在造模第2天即出现腹泻，随后出现大便稀溏，第4天出现便血、行动迟缓、体质量下降、精神萎靡不振、毛发黯淡无光症状。GSPE各给药小鼠组也出现便溏、便血等症状，但症状均轻于模型组。

3.2GSPE对DSS诱导的UC小鼠体质量和脾脏质量的影响

各组小鼠体质量变化情况如图1所示，对照组小鼠体质量没有明显变化，其余各组小鼠体质量均有所下降。与对照组比较，模型组小鼠脾脏质量显著增加（P＜0.01），说明DSS模型构建成功。与模型组比较，GSPE给药组小鼠体质量均高于模型组（P＜0.01），脾脏质量显著降低（P＜0.01），说明GSPE对UC小鼠的症状有一定的改善。

3.3GSPE对DSS诱导的UC小鼠结肠长度的影响

各实验组小鼠结肠长度结果如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠结肠长度明显缩短（P＜0.01），说明DSS诱导后小鼠出现了UC，模型制备成功。与模型组比较，GSPE给药后小鼠结肠长度明显增加（P＜0.01），说明GSPE对UC有一定的治疗作用。

3.4GSPE对DSS诱导的UC小鼠结肠组织病理改变的影响

HE染色结果如图3所示，对照组小鼠结肠组织结构完整，无溃疡，无损伤，肠腺排列整齐且完整，黏膜未见炎性细胞浸润，肌层保持完整平滑。模型组小鼠结肠组织结构已经被完全破坏，黏膜上层细胞脱落、坏死，大量炎性细胞浸润、充血。柳氮磺吡啶组小鼠结肠组织只有局部组织损伤，可见少量炎性细胞浸润。GSPE低剂量组小鼠结肠组织局部损伤较严重，黏膜上皮细胞部分坏死，炎性细胞浸润程度稍强于模型组；中剂量组结肠组织局部损伤，可见到部分完整的组织构造，少量炎性细胞浸润；高剂量组结肠组织稍有损伤，绒毛清晰，黏膜无损伤、无坏死、无炎性细胞浸润，说明GSPE剂量越高改善效果越明显，呈现显著的量效关系。

按病理组织学诊断指标对染色结果进行评分，结果见表1。与对照组比较，模型组小鼠结肠组织病理评分明显升高（P＜0.05），提示DSS对结肠造成严重损伤，造模成功形成了UC。与模型组比较，GSPE中、高剂量组小鼠结肠组织病理评分显著降低（P＜0.01），提示GSPE能够有效改善DSS诱导的小鼠结肠黏膜损伤、炎症细胞浸润。

3.5GSPE对DSS诱导的UC小鼠血清及结肠组织炎症因子水平的影响

采用ELISA法测定小鼠血清和结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，结果如图4所示，模型组小鼠各炎症因子水平显著高于对照组，说明UC造模成功。与模型组比较，GSPE各给药组小鼠血清和结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低（P＜0.05），说明GSPE能够抑制DSS诱发的UC小鼠结肠组织、血清中细胞炎症因子的增加，从而抑制炎症的发生、发展。

3.6GSPE对DSS诱导的UC小鼠血清及结肠组织中细胞因子水平的影响

结果如图5所示，与对照组比较，模型组小鼠血清和结肠组织中NO、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，GSPE各剂量组小鼠结肠和血清中NO、MDA水平均显著降低，SOD水平升高（P＜0.01），说明GSPE能有效地促进UC小鼠结肠组织和血清中SOD的增加，抑制MDA和NO的产生，从而发挥着抗氧化的作用，来调节体内的氧化应激反应。

3.7GSPE对DSS诱导的UC小鼠结肠组织中蛋白表达的影响

4讨论

NF-κB是免疫网络中至关重要的细胞活化、信号转导以及转录激活因子[17-19]，在UC发生发展过程中发挥核心作用[20]，对细胞因子、黏附因子、免疫性受体、促凋亡蛋白均有调控作用[21-22]。NF-κB的活化异常是UC发病的生理、病理学机制之一，其表达水平可作为UC病情及治疗效果的评估指标[23]。NF-κB活化后可使多种细胞因子完成基因转录，导致炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的大量表达，最终引起机体的损伤。因此在NF-κB通路中，NF-κB水平下降说明药物通过该机制发挥了抗炎作用。研究结果显示GSPE可以有效下调结肠组织中NF-κB蛋白表达水平，减少NO、TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的生成，抑制炎症的发生和发展。

UC的发病与机体氧化应激失衡密不可分，过氧化反应是发生UC的重要因素，氧自由基水平的升高会激发炎症反应[24]，活性氧自由基的产生超过了机体对过氧化物的清除能力会使机体的氧化系统和抗氧化系统失衡[25]，体内过多的活性氧自由基会导致脂质过氧化、蛋白质变性及诱发基因突变，最终导致细胞的氧化损伤[26]。酶抗氧化防御系统和脂质过氧化是反应氧化应激的经典指标，酶抗氧化系统包括SOD等酶，脂质氧化损伤后的产物是MDA。Keap-1/Nrf2是经典的抗氧化通路，生理状态下，胞浆内的Keap-1起接合器的作用，通过泛素连接酶与Nrf2结合在一起，Nrf2被蛋白酶降解。当氧化应激反应出现，Keap-1作为氧化还原反应的传感器，其构象发生变化时Nrf2解离，转入细胞核内激活靶基因表达，调控下游II相代谢酶（如HO-1）、抗氧化酶（如SOD）的表达，进而发挥抗氧化损伤的作用，恢复细胞的内稳态[27]。因此在Keap-1/Nrf2抗氧化通路中Nrf2和HO-1蛋白表达水平升高表明药物通过该机制发挥了抗氧化作用。本研究结果显示GSPE可以有效升高细胞中SOD水平，降低细胞中MDA水平，升高Nrf2和HO-1蛋白表达水平，发挥抗氧化作用。

有研究表明，NF-κB信号通路与Nrf2信号通路存在串扰关系，NF-κB可以抑制转录时Nrf2的信号传导，Nrf2和HO-1与促炎因子的表达与NF-κB的失活有重要联系[28]。Keap-1在细胞抗炎方面起着重要的作用[29-30]，可以直接作用于NF-κB信号通路，其主要是通过调控IKKβ影响NF-κB信号通路，IKKβ是NF-κB信号通路中激酶复合物的核心组成部分，其活性增强可有效激活NF-κB信号通路。Keap-1特异性结合IKKβ，并与泛素连接蛋白CUL3-RBX1复合体相连，介导IKKβ的泛素化降解[31]，阻止了NF-κB磷酸化入核，减轻炎症反应。本研究结果表明，GSPE可以上调Nrf2蛋白表达水平，进而促进其下游蛋白HO-1的蛋白表达，上调结肠组中SOD水平，下调MDA水平，进而调节氧化应激失衡，发挥其抗氧化作用，缓解炎症反应。

本实验结果表明GSPE能够剂量依赖性地降低NF-κB蛋白表达水平，降低细胞炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，上调Nrf2和HO-1蛋白表达水平，上调结肠组织中SOD水平，下调MDA水平，改善UC小鼠组织病理变化，从而改善UC疾病症状。GSPE可能是通过Nrf2和HO-1抗氧化通路和NF-κB抗炎通路发挥治疗作用的。

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