华盛顿大学圣路易斯医学院病理学与免疫学的GerardE.Kaiko,StacyH.Ryu等人，年在《Cell》（IF28.71；细胞生物学分类下的1区期刊）发表了题为“TheColonicCryptProtectsStemCellsfromMicrobiota-DerivedMetabolites”的文章。文章主要内容为：

肠上皮干/祖细胞定位于哺乳动物肠壁的利氏肠腺隐窝中。哺乳动物肠腔内也包含能够调节干/祖细胞活性的各种微生物代谢产物。本实验筛选并确定了细菌的一个主要代谢物——丁酸，在适当的生理浓度时是肠干/祖细胞增殖有效的抑制剂。在生理平衡状态下，分化的结肠细胞能代谢丁酸，阻止它到达隐窝抑制上皮干/祖细胞的增殖。在体内实验中，由于肠道细胞粘膜损伤或使用天然无隐窝肠道组织所造成的干/祖细胞暴露于丁酸状态，将会导致干细胞增殖受到抑制、肠道伤口修复被延迟。丁酸的作用机制依赖于转录因子Foxo3。作者的研究结果表明哺乳动物的隐窝结构对干/祖细胞增殖的保护，在某种程度上是通过分化的结肠细胞形成的代谢屏障消耗了丁酸。作者的研究将激发之后机体结构和微生物代谢相互作用的研究。

肠上皮是动物体内更新速度最快的组织之一,其功能的正常发挥依赖于在隐窝底部的肠道干细胞和祖细胞，Wnt，Hedgehog和Noggin等机体信号通路影响着这些干细胞的生长和更新。尽管近三个世纪就已知道他们的存在，也有文献报道虽然内腔环境中存在着具有潜在损伤作用的致病侵入性微生物和遗传毒性试剂，而隐窝可以对干细胞和祖细胞产生保护作用。但并没有直接的支持隐窝保护理论的证据，隐窝结构的确切功能机制仍不清楚。

许多研究提出微生物群的作用是通过免疫细胞-上皮交联促进肠道上皮修复，促进宿主细胞调节基本生理过程的重要介质可以是极小且可扩散的微生物代谢物，那么特异性微生物来源的信号究竟是如何直接影响隐窝内肠的干/祖细胞的呢？

在过去的十年中，人们建立了多种研究肠干细胞的方法，包括从多能干细胞中诱导出肠道干细胞、通过添加重组干细胞生长因子分离隐窝并进行永久培养等。这些方法推进了人们对干细胞维持机制的了解。然而，这些方法主要是培养细胞群，更新能力较低。最近，作者研发了一个以高通量功能筛选和培养大量原代肠干细胞和祖细胞的体系。

为了确定定植微生物群及其可溶性代谢物对肠上皮祖细胞的影响，作者利用野生型小鼠中的微生物代谢物，就这些代谢物和已知的病原体相关分子（PAMP）对干细胞和祖细胞活性的影响进行了筛选分析。

1.原代肠道上皮细胞的分离

2.动物模型建立

3.代谢分析、流式、免疫组化

4.ChIP-Seq

1.对微生物代谢物的筛选揭示了若干结肠上皮干/祖细胞增殖的抑制剂

从野生型小鼠肠道微生物代谢产物和PAMP中，作者对影响肠干/祖细胞活性的代谢物进行了筛选。转基因小鼠分裂期蛋白Cdc25A启动子与Luci偶联，分离标记原代结肠上皮细胞，然后富集培养快速分裂的Lgr5+干/祖细胞用于代谢物的筛选（图1A）。初筛了8个代谢物可抑制干/祖细胞的增殖（图1B）。基于每个代谢物腔内浓度剂量反应进行次级筛选。在八种代谢物中，生理浓度的丁酸对结肠干/祖细胞的增殖的抑制作用最为有效（图1C，2A，2B）。

图1.微生物代谢物作为结肠上皮干/祖细胞有效的抑制剂的高通量筛选鉴定

丁酸是细菌发酵膳食纤维的产物，并且是在哺乳动物结肠内腔中发现的最丰富的代谢物之一。在短链脂肪酸中，丁酸对上皮增殖的作用是特异性的，而丙酸和乙酸则没有作用（图2C）。丁酸抑制效果在1mM剂量下是可逆的，但是在较高浓度下会诱导永久凋亡（图2D，2E）。这些发现提示丁酸对免疫细胞炎症作用不一定是完全的有益作用，但其对结肠上皮干/祖细胞增殖具有抑制作用。

图2.相比其他SCFA，丁酸可抑制结肠上皮干/祖细胞增殖

2.隐窝结构保护结肠干/祖细胞免受丁酸介质的抑制

作者假设隐窝结构通过隔离腔内高浓度丁酸来保护干/祖细胞。通过直接灌肠（增加）或抗生素（消除产丁酸的微生物）改变小鼠腔内丁酸量，或直接用无菌小鼠实验，结果都显示对肠道增殖没有影响（图3A）。作者接下来用缺乏隐窝但仍具有肠上皮更新能力的斑马鱼进行实验。不像其他哺乳动物，斑马鱼没有隐窝（图3B，缺乏微生物及产生丁酸的酶，且其肠干/祖细胞暴露于腔内（图3C）。作者观察到斑马鱼测试隆起区域暴露于丁酸后有效抑制内皮细胞的增殖（图3D，3E）。这支持了隐窝具有阻止丁酸对干细胞/祖细胞增殖影响作用的功能。

图3.结肠隐窝结构保护上皮干/祖细胞免受丁酸抑制

基于丁酸在小鼠和斑马鱼中的效应，作者假设隐窝限制了丁酸进入到干/祖细胞。作者主要通过两种方法去除上皮，使干/祖细胞暴露于内腔丁酸中。一种是在小鼠中用右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导结肠溃疡，在隐窝邻近溃疡时外源性丁酸减少了上皮增殖（图4A和4B）。在单独的实验中，小鼠先用甲硝唑预处理去除产丁酸微生物，然后发现DSS治疗后溃疡面积减小。添加外源丁酸或粪便移植，会加重肠溃疡。作者还用活检钳切除了肠壁1平方毫米结肠粘膜的片段。这个模型揭示了外源丁酸对邻近伤口区域隐窝内干/祖细胞增殖的类似抑制效应（图4C-4E）。因此，在暴露时丁酸抑制干/祖细胞增殖。

图4.粘膜损伤使干细胞/祖细胞暴露于丁酸抑制增殖

3.结肠细胞保护干细胞/祖细胞是通过氧化代谢和包埋丁酸

为了测试结肠细胞在体外是否保护干/祖细胞细胞免受丁酸抑制，作者在结肠细胞或干/祖细胞培养基添加丁酸，结果显示与结肠细胞预孵育时能显著减少培养基中30％丁酸的量并解除了对增殖的影响（图5A）。表明结肠细胞通过代谢丁酸起到了保护作用。微阵列芯片显示结肠细胞高度富含TCA循环和脂代谢的mRNA编码酶；显著更高的OCR/ECAR比值表明结肠细胞相比干/祖细胞在更大程度上依赖氧化磷酸化生成ATP（图5B）；结肠细胞利用丁酸作为氧化磷酸化的底物，通过2-DG处理抑制糖酵解时OCR稳定降低，添加丁酸可剂量依赖性的维持OCR/OXPHOS；在该试验中，鱼藤酮和抗霉素处理实验结果证实它是由于线粒体氧化磷酸化造成的（图5C和5D）；体外使用13C同位素标记丁酸，结果显示在隐窝顶部细胞有3倍水平的13C同位素标记乙酰-CoA（图5F）。总的来说，结肠细胞可以将丁酸作为能量来源来代谢，从而潜在地防止干细胞暴露在高浓度的腔内丁酸中。

图5.结肠细胞通过丁酸的代谢分解保护干/祖细胞

4.结肠细胞通过Acads-依赖性氧化屏蔽干细胞/祖细胞免受丁酸抑制

相比隐窝表面，隐窝底部丁酸水平较低。然而，作者认为隐窝结构并不是唯一保护干/祖细胞的机制，结肠细胞也可以代谢丁酸进一步降低隐窝底部丁酸的水平。作者利用小鼠乙酰-CoA脱氢酶（Acads）缺陷型对此进行分析。首先对体内和体外结肠细胞的Acads表达进行了检测（图6A和6B）。然后代谢分析表明：在体外，与WT细胞相比，缺陷型细胞丁酸氧化显著减少（图6C）；在隐窝增殖区，缺陷型与WT小鼠相比上皮增生显著减少。在没有受伤的情况下与WT小鼠相比，口服外源丁酸更能减少缺陷型小鼠隐窝增殖区。（图6D-6F）。在DSS损伤期间隐窝周围溃疡，缺陷型小鼠表现出强力抑制干/祖细胞增殖。有和没有外源性丁酸处理这都会发生（图6G，6H）。这些数据表明结肠细胞通过Acads依赖机制代谢丁酸和保护底部的干/祖细胞。

图6.结肠细胞通过Acads依赖机制代谢丁酸和保护底部的干/祖细胞

5.丁酸通过Foxo3依赖性机制抑制干/祖细胞

作者考察了两种候选途径：1）刺激G蛋白偶联受体（GPCR），（2）抑制组蛋白脱乙酰酶（HDAC）。在过抑制和过表达GPCR通路时，丁酸不能抑制增殖。作者发现丁酸抑制HDAC活性呈剂量依赖关系（图7A），且H3K27和H3K9乙酰化增加（图7B）。为了进一步探讨这一机制，作者利用ChIP-seq和甲醛辅助分离调节元件测序（FAIRE-seq）确定丁酸提高上游2kb区域内转录起始位点H3K27乙酰化的位点（图7C）。基因表达平行分析显示了丁酸处理后的转录丰度（图7D），作者集中对Foxo1和Foxo3启动调节因子进行了研究。抑制Foxo1和Foxo3活性的物质能显着逆转丁酸的作用（图7E），但只有Foxo3基因敲除时会强烈抑制丁酸的作用（图7F）。丁酸增加了Foxo3启动调节因子的活性，并促进Foxo3结合到Cdkn1a，Cdkn1c和Gadd45b的启动区（图7G），还提高了这三种基因mRNA表达量（图7H）。最后，作者先对小鼠进行粘膜DSS损伤，然后灌肠给予Foxo抑制剂。结果表明这逆转了丁酸对上皮增殖的影响（图7I和7J）。

图7.丁酸通过Foxo3-依赖机制抑制干/祖细胞

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