PowellN,PantaziE,PavlidisP,TsakmakiA,LiK,YangFF,ParkerA,PinC,CozzettoD,MinnsD,StolarczykE,SaveljevaS,MohamedR,LavenderP,AfzaliB,Digby-BellJ,Tjir-LiT,KaserA,FriedmanJ,MacDonaldTT,BewickGA,LordGM.Interleukin-22orchestratesapathologicalendoplasmicreticulumstressresponsetranscriptionalprogrammeincolonicepithelialcells.Gut.Mar;69(3):-.

研究背景

炎性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是一种典型的免疫介导的炎性疾病（IMID）。IBD的特点是肠道内免疫细胞的过度积累并诱发复杂的炎症反应。与其他IMID的情况类似，IBD的确切病因未知，细胞因子和免疫途径发挥的作用难以确定，抗炎及组织修复因子又增加其复杂性。白细胞介素22（IL22）是一个备受争议的细胞因子。研究表明，在急性自限性损伤引起的肠上皮损伤的动物模型中，IL22通过促进LGR5+上皮干细胞再生/增殖保护胃肠道健康。在柠檬酸杆菌引起的急性结肠感染中，IL22可以快速修复结肠上皮细胞并发挥保护作用。同样，当短期使用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导急性损伤后，IL22促进上皮恢复原状。在甲氨蝶呤化学治疗剂诱发的自溶性粘膜炎后，IL22在急性小肠上皮损伤中发挥修复作用。上述研究表明IL22可能促进IBD的上皮修复作用。然而，IBD并非急性炎症性疾病，大多数患者也并非原发性上皮缺损所引起。全基因组关联研究（GWAS）检测发现，大多IBD的疾病风险基因定位于免疫基因。IBD的临床前模型表明，IL22可能是疾病的诱因。阻断IL23（负责触发IL22产生的关键上游细胞因子）在IBD的早期治疗中发挥重要作用。此外，高血清IL22水平可预测抗IL23治疗的反应。本研究旨在探讨IL22在慢性结肠炎中的作用，评估重组IL22给药对活动性IBD患者的治疗作用。

研究结果

1.IL22调节结肠上皮细胞中的内质网（ER）应激反应转录模块，IL17A处理增强该模块

为探究IL22和结肠上皮之间的相互作用，作者用重组IL22处理上皮类器官（colonoids）系统，并通过基因表达微阵列分析检测转录反应，结果表明，IL22调控个基因的表达（Fig.S1），其中包括编码抗微生物肽的基因，如IL22反应性转录本Reg3b和Reg3g，以及包括钙卫蛋白亚基Sa8/Sa9、lipocalin-2（Lcn2）和乳铁蛋白（Ltf）在内的其他抗菌肽。然而，IL22对α防御素或β防御素家族抗菌肽的表达没有影响。IL22显著上调涉及微生物传感和上皮屏障功能的转录本（Tlr4，Myd88，Tnfaip3），包括编码重要结肠上皮紧密连接蛋白的claudin家族基因（Fig.1A）。据报道IL22可诱导体内及体外小肠上皮细胞的ER应激，这一作用与实验性小肠炎症的敏感性增强有关，特别是在Atg16l1缺乏的情况下。感染性、代谢性、毒性或炎性细胞损伤可损害ER中蛋白质的合成，导致毒性错误折叠蛋白质积聚和ER应激。未折叠蛋白质反应（UPR）是高度保守的细胞过程，可减轻蛋白质错误折叠所致的有害影响。在作者构建的colonoids中，IL22显著上调负责控制UPR的关键转录本（Fig.1A）。

为进一步了解结肠上皮中病理性ER应激反应的转录结构，作者使用病理性ER应激反应化学诱导剂衣霉素处理colonoids，基因集富集分析显示，衣霉素显著调节colonoids中个基因的表达（Fig.S2）。IL22处理的结肠上皮中，特异性ER应激反应转录模块显著富集（Fig.1B）。作者通过RNA测序检测IL22处理的WT和Il22ra1-/-colonoids中ER应激反应转录产物的表达，结果显示，IL22仅诱导WTcolonoids中ER应激反应转录产物的表达，进一步证实该通路依赖于IL22受体（Fig.1C）。作者通过基因本体（GO）分析发现，有关“ER应激反应”和“ER应激超负荷反应”的转录本显著丰富（Fig.1D）。

作者通过微阵列分析观察到，IL22协同增强衣霉素诱导的ER应激基因的转录（Fig.1E），表明IL22也可能增强其他介质驱动的ER应激反应。据报道，IL22通常与IL17A共同产生。因此，作者探究了IL22与IL17A是否具有协同作用以驱动ER应激反应。IL17A单独处理colonoids仅微弱增加ER应激相关的转录物；当IL17A与IL22联合处理colonoids时，对UPR转录本的诱导作用更强（Fig.1F）。此外，IL22和IL17A协同增强colonoids中ER分子伴侣GRP78的蛋白表达（Fig.1G，H）。上述结果表明，IL22调节结肠上皮细胞中ER应激反应转录模块，IL17A处理增强这一作用。

2.IL22和IL17A促进内质网应激和肠道上皮细胞凋亡

除ER应激反应转录本上调外，作者还观察到了影响结肠上皮炎症的转录本上调，其中包括有关凋亡易感性的转录本上调。IL22处理增强Tnf（促炎和促凋亡细胞因子）、一氧化氮合成酶（NOS2）（被证明是上皮炎症、致癌和ER应激的触发因子）、促炎/促凋亡细胞内分子Sting（Tmem）及caspase12（它本身锚定在ER中，负责调节与ER应激相关的细胞凋亡）的表达（Fig.2A）。通路分析（PANTHER）结果表明，在IL22调控的转录本中，白介素介导的信号通路、趋化因子及细胞因子介导的炎症信号通路和Toll样受体信号通路显著富集，但最丰富的途径是凋亡途径（Fig.2B）。

为确定IL22是否影响结肠上皮细胞生存，作者通过MTT法检测用IL22、IL17A、IL22+IL17A或衣霉素处理的colonoids中上皮细胞的生存能力。MTT结果显示，衣霉素处理的colonoids中上皮细胞活力显著降低。尽管IL17A和IL22单独处理并不影响细胞生存，但IL22和IL17A联合处理显著抑制colonoids中的细胞生存（Fig.2C）。为确定IL22和IL17A是否可以在体内影响肠道上皮细胞凋亡，作者在肠道上皮细胞凋亡模型中评估了细胞因子给药的影响。单独肿瘤坏死因子-α（TNFα）处理可快速诱导上皮细胞凋亡，绒毛尖端伴有绒毛缩短，有液体渗出到肠腔，出现腹泻症状（Fig.2D）。这种反应可在TNFα处理后约90分钟后检测到，在分钟时最为明显，管腔内可见大量脱落细胞，绒毛上有大量TUNEL+和caspase-3+上皮细胞，在分钟绒毛逐渐变细（Fig.2D-F）。当用IL22预处理时，肠上皮细胞从60分钟开始强烈脱落。IL22/IL17A联合处理进一步加速该反应，仅用40分钟就观察到细胞脱落和细胞凋亡的增加（Fig.2D-F）。对caspase-3+细胞的定量研究显示，IL22和IL22/IL17预处理均显著提高对TNFα的凋亡反应（Fig.2D-F）。总之，上述结果表明，IL22促进结肠上皮细胞凋亡，当与IL17A联合处理时进一步增强该反应。在慢性炎症中，当其他促凋亡因子（如TNFα）含量丰富时，或者存在可致细胞凋亡的未激发的ER应激反应时，这种能力更为明显。

为探究IL22/ER应激轴在慢性结肠炎中的作用，作者构建了可发展成慢性菌群依赖性结肠炎的TRUC小鼠模型，与IL22处理的colonoids结果一致，大多数IL22诱导的转录本在TRUC小鼠的结肠中也被上调（Fig.3A）。IRE1α作为一种ER跨膜传感器，在TRUC小鼠结肠上皮中的表达增高（Fig.3B）。作者选取Villin-cre×Atg16l1fl/fl小鼠作为阳性对照，该小鼠自噬功能受损导致病理性ER应激反应，在其结肠上皮细胞中IRE1α的表达也增高（Fig.3B）。免疫印迹证实，与Rag2-/-小鼠相比，TRUC小鼠结肠中Grp78蛋白表达增加（Fig.3C）。在TRUC小鼠中使用ER应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）可减轻ER应激并显著减轻结肠炎（Fig.3D）。为进一步探究IL22在体内驱动上皮ER应激的作用，作者构建了TRUCIL22-/-基因敲除小鼠和IL22抗体阻断小鼠。与TRUC小鼠相比，IL22的缺失显著降低ER应激水平，减轻结肠炎症状（Fig.3E-H）。总之，IL22在TRUC小鼠的慢性结肠炎中发挥重要作用，靶向IL22或上皮细胞的病理性ER应激可以减轻结肠炎。

4.局部诱导ER应激使健康的TRUCIL22-/-小鼠诱发结肠炎

由于TRUCIL22-/-小鼠结肠不发生ER应激而免于诱发结肠炎。作者探究在IL22缺失的情况下，直接诱导结肠上皮ER应激能否诱发结肠炎。作者用衣霉素处理对照及健康的TRUCIL22-/-小鼠直肠。与对照小鼠相比，衣霉素诱导的TRUCIL22-/-小鼠结肠炎的结肠肿块增加并且表现出特征性的结肠炎组织学改变（Fig.4A,B）。

5.IBD患者结肠中IL22反应性转录本增加，并与关键生物标志物和粘膜损伤的严重程度相关

为探究上述观察结果是否与人类结肠炎有关，作者检测了患有活动性结肠炎的CD患者结肠组织中IL22反应性转录网络的表达及ER应激反应水平。作者对UNITI研究中大量患有活动性结肠CD患者的转录组学、血清学和临床数据进行了研究。UNITI研究是一项大型第三阶段临床试验，评估了治疗CD的新药物ustekinumab的功效。ustekinumab是针对于IL12和IL23共同的p40亚基常见的人IgG1κmAb。作者在基线（即给药前）和给药后纵向取样进行结肠活检。与健康对照组相比，在UNITI-1和UNITI-2人群中，血清IL22浓度均显著升高（Fig.5A）。作者通过分析IL22处理的colonoids中20种明显上调的转录本的人类同源物，定义了IL22反应性转录程序。基因集变异分析（GSVA）发现，IL22反应性转录模块显著富集（Fig.5B）。在UNITI队列中，可获得大量表型数据，包括疾病活动评分，内窥镜严重程度评分和炎性生物标记物的检测。其中，IL22反应性转录本的富集评分与疾病活动和严重程度的生物标志物如粪便乳铁蛋白和钙卫蛋白的浓度有关（Fig.5C，D）。此外，直肠内活检组织中的IL22富集评分与内镜检查时粘膜损伤的严重程度相关（Fig.5D）。主成分分析表明，IL22反应性转录本可用于判断直肠上皮内是否存在溃疡（Fig.5E）。为进一步探究IL22反应性转录本与粘膜损伤严重程度之间的相关性，作者评估了IL22反应性转录本预测克罗恩病内镜评分（SES-CD）的能力。通过UNITI-1数据集模型预测基线SES-CD为r2=0.82（Fig.5G，H），测试组中r2范围在0.35和0.64之间，在IL22处理的第8周直肠中r2值最高（r2=0.64，Fig.5H），这表明IL22反应性转录本可以预测CD结肠中粘膜损伤的严重程度。

6.上皮细胞特异性内质网应激驱动的转录程序在活动性结肠炎中富集，并与IL22转录相关

为探究活动性结肠炎患者结肠中的ER应激反应转录程序是否被富集，作者鉴定了衣霉素在鼠colonoids中诱导的基因，并将其与参与ER应激通路的人类同源物进行交叉引用，从而生成了62个基因列表（Fig.6A）。GSVA证实，在UNITI队列中的CD患者结肠中，结肠上皮细胞特异性ER应激反应转录模块显著富集（Fig.6B），并在结肠CD和UC患者的独立数据集中富集（Fig.6C）。通过对62例ER应激反应转录本的表达进行无监督分层聚类分析，可区分结肠CD患者和非炎性对照患者（Fig.6D），并且可以反映其与主要疾病特征的强相关性，包括粪便乳铁蛋白浓度（Fig.6E）和内镜检查粘膜损伤的严重程度（Fig.6F）。与IL22在人类结肠炎中驱动ER应激转录模块的作用一致，CD患者结肠中IL22应答转录本的富集程度与ER应激转录模块的富集程度显著相关（Fig.6G）。

7.体内阻断IL23/IL22轴可逆转CD结肠炎的内质网应激

为检测阻滞IL22产生的关键细胞因子IL23能否抑制人结肠炎中结肠上皮ER应激，作者选择了部分UNITI试验队列中使用ustekinumab或安慰剂治疗的患者的结肠转录组，并分别提取了在基线、第8周和第44周收集的结肠活检样本的RNA。结果显示，在安慰剂治疗的CD患者直肠中内质网应激蛋白（XBP1）或GRP78的表达无明显变化，但在ustekinumab治疗的患者中，到第44周时这些转录物的表达显著降低（Fig.7A）。在安慰剂治疗的CD患者的结肠中，上皮细胞特异性转录模块的富集保持不变，而在用ustekinumab治疗的患者中，该模块富集显著降低（Fig.7B）。总之，上述结果表明与IL23/IL22轴在IBD结肠受累患者中的作用同在调节结肠上皮ER应激中的作用相一致。

研究结论

1.结肠上皮细胞中，IL-17A增强IL-22诱导的ER应激反应转录模块，促进肠道上皮细胞凋亡。

2.IL-22是慢性结肠炎中结肠ER应激的驱动因素，靶向IL-22可缓解结肠上皮细胞ER应激并减轻结肠炎。

3.IBD患者结肠中IL-22反应性转录产物增加，并与粘膜损伤的生物标志物和严重程度相关。

4.活动性结肠炎中上皮细胞特异性ER应激驱动转录程序增加，并与IL-22反应性转录产物相关。

5.阻断IL-23/IL-22轴，可逆转克罗恩病患者结肠上皮细胞的ER应激反应。

校样：刘铭迪

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