作者：周炜洵，凌庆，罗玉凤（中国医学科学院北京协医院病理科）杨红（中国医学科学院北京协医院消化内科）

　　来源：《中华病理学杂志》

　　注：本文经《中华病理学杂志》授权发布，其他媒体转载或引用须经《中华病理学杂志》同意，否则追究法律责任。

　　目的：探讨胃肠道巨细胞病毒（CMV）感染性疾病的临床病理特点及组织学检测的方法和效果。方法：收集年7月至年7月临床疑诊消化道CMV感染的患者35例，组织学标本41份，HE切片观察组织学形态，并行CMV免疫组织化学及原位杂交检测CMV感染细胞。组织学检测结果与患者血标本CMVDNA、pp65抗原等检测结果比对。结果：41份标本中23份检测到CMV感染细胞，32份组织学检测前后1周内有血DNA检测，结果与组织学检测比较，血DNA检测的敏感性73.7%，特异性69.2%。结论：胃肠道组织学检测CMV在临床实践中具有重要应用价值，HE结合免疫组织化学和/或原位杂交检测是可靠的检测方法。

　　巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是一种双链DNA病毒，通过密切接触、体液传播，在人群中的总体感染率达40%～%[1]。通常首次感染后长期携带，在免疫功能低下时再活化而引起临床症状，致CMV病。免疫缺陷或免疫抑制的患者容易发病，可致患者死亡。CMV病可累及呼吸、循环、消化等多个系统，造成多系统症状，其中消化道症状较为常见，特别是在炎症性肠病应用免疫抑制治疗过程中多见。临床工作中常常需要明确CMV的感染状态，以指导治疗。我们分析了35例临床疑诊CMV感染患者肠道标本的组织病理特点，以期增加对肠道CMV病的认识和相关检测的了解。

　　资料与方法

　　1.病例资料

　　医院年7月至年7月临床疑诊消化道CMV感染的患者35例。患者中男性23例，女性12例，年龄24～73岁，中位年龄51岁。其中溃疡性结肠炎27例，克罗恩病1例，未明确分类的炎症性肠病3例，骨髓异常增殖症骨髓移植后1例，胸腺瘤术后低免疫球蛋白血症1例，肺部感染1例，不明原因消化道出血1例。收集临床资料，患者血液标本CMV检测情况，包括DNA、pp65抗原、IgM检测。与病理检查时间相对应，记录病理检查前后各1周内的血液标本CMV检测情况。查阅临床抗病毒治疗及疗效。

　　2.试剂

　　CMV免疫组织化学抗体采用Dako公司的小鼠抗人抗体（克隆号DDG＋CCH2），购自北京西雅金桥生物技术有限公司，应用EnVision二步法显色系统。原位杂交探针采用Leica公司的即用CMV探针，购自北京协力锐创商贸有限公司，应用BOND自动杂交系统。

　　3.CMV感染判断标准

　　35例患者共取得肠道组织标本41份，全部标本经4%中性缓冲甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm切片，HE染色观察光镜下组织学形态，并做CMV免疫组织化学及原位杂交检测。HE观察组织内见到明显增大的细胞，胞核见嗜碱性包涵体，为CMV感染细胞。免疫组织化学及原位杂交显示为感染细胞的棕褐色核染色或胞质染色。免疫组织化学或原位杂交切片至少见到一个阳性细胞判为阳性。

　　结果

　　组织切片HE染色观察，多数病例可见明确的肉芽组织，提示溃疡存在。可见CMV累及的细胞核，明显增大，可达3～4个淋巴细胞核大小。胞核呈嗜碱性，可见均匀深染或云雾状的CMV包涵体（图1）。有时包涵体略小，周围有明显的空晕，似“鹰眼”（图2）。也有时因在平滑肌细胞核中，呈长条形状。感染细胞最常见于肉芽组织中的内皮细胞，也可以见于平滑肌细胞和上皮细胞。HE观察见到CMV受累细胞16例。

　　图1巨细胞病毒（CMV）感染细胞，细胞明显增大，胞核呈嗜碱性，见均匀深染或云雾状的CMV包涵体HE高倍放大

　　图2CMV感染细胞，有时包涵体略小，周围有明显的空晕，似“鹰眼”，为感染的内皮细胞HE高倍放大

　　图3CMV感染的内皮细胞，免疫组织化学染色显示感染细胞EnVision法高倍放大

　　图4CMV感染的内皮细胞原位杂交显示病毒包涵体原位杂交高倍放大

　　免疫组织化学染色显示CMV累及的细胞核，为均匀深染的棕褐色核着色，有时呈弥散式胞核及胞质着色（图3）。原位杂交染色表现为致密的，胞质为主的棕色染色（图4）。41份标本中免疫组织化学阳性22份，原位杂交阳性22份，其中21份共同阳性。综合HE染色、免疫组织化学及原位杂交结果，41份标本中23份检测到CMV。

　　35例患者中6例患者前后进行2次CMV组织学检测，时间间隔8d至3个月不等。其中1例患者出现2份检测结果不同，首次检测阳性，10d后检测阴性。

　　41份病理检查前后1周内，有32份进行了血CMVDNA检测。血DNA阳性18份，阴性14份。其中有8份超过拷贝/mL，全部为组织学阳性的病例。与组织学检测比较，血液DNA检测的敏感性73.7%，特异性69.2%。当血DNA定量大于拷贝/mL时，敏感性42.1%，特异性.0%。病理检查前后1周内共10例检测了pp65抗原血症，6例阳性，4例阴性。与组织学CMV检测相比，敏感性83.3%，特异性75.0%。血DNA及pp65抗原血症检测结果与组织学比较见表1。7例检测了血IgG，均为阳性，仅1例重复检测IgG，无明显差异。14例检测了IgM，2例阳性，均为组织学阳性患者。

　　讨论

　　CMV病毒属疱疹病毒科β属双链DNA病毒。类似于其他疱疹病毒，一旦感染可终生潜伏，在机体免疫力下降时再活化而致病。令人惊讶的是，CMV感染非常普遍，常见于所有人群，人群中的感染率达40%～%[1]。因此，免疫功能低下患者特别容易发病，并且可以致死。CMV基因表达在有重叠的3个时相：极早期、早期和晚期。极早期表达的蛋白主要是外壳蛋白，早期是病毒DNA复制时期，晚期表达一些结构蛋白[2]。CMV感染呈现原发、潜伏及再活化的不同情况。原发感染可发生在儿童早期，此后呈潜伏状态，可长期无症状。通常，“CMV感染”用于潜伏状态，血浆检测可阳性但无临床症状；“CMV病”用于再活化，有临床症状和器官受累的证据[2,3]。急性CMV感染可无症状或显示发热、乏力、不适、淋巴结肿大、皮疹等非特异症状。再活化可累及消化道、肝、神经系统、肺、眼、心血管系统等[4,5]。其中消化道疾病可累及消化道全程，比较常见，并且较为容易获得活检标本，组织学诊断占有重要的地位。

　　CMV再活化易发生在免疫功能低下患者，如HIV感染者、移植术后、炎症性肠病患者等。炎症性肠病合并CMV肠病比较多见，有报道总体发病率在溃疡性结肠炎达4.6%，在克罗恩病中有0.8%[6]。CMV肠病患者多数有应用糖皮质激素或免疫抑制剂的历史，表现为结肠炎加重和激素难治性结肠炎[5,7]。实际上，CMV肠病的发病机制、CMV在炎症性肠病时如何活化及复制等问题尚不明确。有学者认为炎症性肠病患者出现CMV，只是个“无辜的旁观者”，可以自行清除[8,9]；但越来越多的证据提示CMV影响炎症性肠病的严重程度，使得患者预后差，导致外科处理增多，甚至病死者增加[7,10]。抗病毒治疗可以令患者受益，特别是长期疗效好，能够维持缓解[11]、延长无手术生存时间[12]。本组有炎症性肠病患者31例，其中19例检测出组织CMV，14例进行了抗病毒治疗，11例治疗后1个月内显示疗效，症状缓解、炎性病变指标下降。

　　由此可见，炎症性肠病患者，特别是溃疡性结肠炎患者，只要临床用免疫抑制剂的严重结肠炎，即应进行CMV检测[13,14]，此外，欧洲克罗恩及结肠炎组织（ECCO）的指南还提出，活检显示大溃疡伴明显肉芽组织时也应进行CMV检测[14]。对于其他病史如移植等原因造成免疫功能低下，也应想到要进行CMV检测。本组即有1例骨髓移植患者及1例胸腺瘤切除术后致低免疫球蛋白血症的患者出现腹泻，抗生素不能改善症状，经检测CMV阳性，抗病毒治疗后症状缓解。此外，没有明显基础疾病，免疫功能正常者也可以发生CMV病[15]，本组1例消化道出血的患者，发病前无基础疾病，检测出CMV，证实为CMV肠炎。因此，对于临床难治性腹泻，内镜检查显示有较深在溃疡，特别是免疫功能低下的患者，诊断时应考虑到CMV的感染，积极检测。

　　对于CMV的检测，可检测血、组织、大便、尿等多种标本，检测的方法也多种多样。目前很多学者把组织HE染色及免疫组织化学作为“金标准”[16,17,18]，HE染色观察到明显增大的细胞（直径25～35μm），嗜碱性核内包涵体[18]，加免疫组织化学证实。组织中检测到CMV，可以明确局部的受累，证实是CMV病而非仅仅是携带状态[19]。多个临床研究表明经组织学证实的CMV肠病，抗病毒治疗有效[12,13,18]。但是在实践过程中，HE染色观察CMV包涵体需仔细寻找，费时费力，仍容易遗漏，有文献报道37.5%的病例被遗漏[18]。本组23份阳性标本中，仅凭HE观察也有7份未能辨别出包涵体，漏诊率达30.4%，相比于结合免疫组织化学/原位杂交的组织学观察，敏感性仅为69.6%。特别是手术切除标本，需检查的面积大，如包涵体数目比较少，非常难以找到。而免疫组织化学及原位杂交能在阴性的背景中显示出棕色阳性染色，非常鲜明，易于发现。

　　免疫组织化学染色不仅能凸显CMV感染细胞，避免HE观察的假阴性[18]，而且被认为是活动性感染伴高CMV复制的标志[20]。免疫组织化学抗体和CMV的极早期抗原和早期抗原反应，在感染早期，呈细胞核染色；在感染晚期，呈弥散式核染色和胞质染色。原位杂交检测CMV的方法是比较新的检测方法，其探针针对早期基因转录RNA，呈现致密的胞质棕色染色，也能够特异性地突出感染细胞。本组23份阳性标本，21份两种方法都能检测到类似的阳性细胞，但分别有1份仅一种方法阳性。计数显示的阳性细胞数量，在同一病例两种方法也略有差异，但各有数量多的病例，总体无差异趋势。其中原因可能有不同组织切面造成的差异，也有可能是因为二者针对不同靶点，存在差异。提示两种方法可以互为补充，共同应用提高阳性检出率。

　　组织HE染色及免疫组织化学、原位杂交检测能明确疾病发病状态，特异性非常好，但由于多数是活检标本，受取材的限制，有时候会出现假阴性的结果。本组有1例患者进行2次活检检测CMV，首次阳性，10d后阴性。期间应用抗病毒药物，提示抗病毒治疗有效，但鉴于2次间隔时间较短，不能除外由于活检取材限制造成的阴性结果。

　　临床上更为常用的方法是检测血液标本，常见的有即时定量聚合酶链反应（PCR）法测病毒DNA，间接免疫荧光法测pp65抗原血症，酶联免疫吸附（ELISA）法测免疫球蛋白IgG、IgM。血CMVDNA检测现在多用即时定量PCR技术，能够提供病毒的负载量，诊断更有价值[18]。血DNA检测可以查到微量的DNA，是非常敏感的检测手段，因其针对特异性的基因，特异性也较好。文献报道血DNA检测的敏感性为65%～%，特异性为40%～92%[18]。但是，许多学者都提出血DNA不能区分潜伏状态或活化状态，不能区分是否有CMV肠道疾病发生，因而并不能很好地提示临床、指导治疗[17,21]。本组内32份病理检查前后1周内检测了血DNA，18份阳性，敏感性73.7%，特异性69.2%。当定量大于拷贝/mL时，特异性能达到%，提示高定量的血DNA水平能比较好地提示CMV感染，取材微创，有一定的临床应用价值。

　　血pp65抗原血症较为特异，有报道阳性率较低[15]，也不能反映肠道疾病，此外其阳性率受白细胞数量的影响[18]。本组在病理检查前后1周共10例检测了抗原血症，与组织学CMV检测相比，敏感性83.3%，特异性75.0%，好于血DNA检测，也是可选择的方法。但因检测病例较少，可能存在一定偏差。血IgG、IgM的应用逐渐减少，主要是因为CMV人群易感，很多人都处在携带状态，病毒再活化后，IgG的滴度需要4倍升高才能诊断，而实际上难有较大改变，IgM也仅轻度升高[18]，检测效果不理想。本组7例检测了血IgG，均为阳性，仅1例重复检测IgG，无明显差异。14例检测了IgM，仅2例阳性，与文献报道一致，临床应用价值有限。

　　此外，即时定量PCR检测活检组织及大便DNA标本是近年来比较新兴的方法。活检组织PCR可谓目前敏感性最高的方法，受到许多学者的青睐[8,19]。一组91例的研究，组织DNA检测对比HE染色及免疫组织化学检测，敏感性达96.7%，特异性98.7%，显示非常好的效果[22]。但同时还需注意此方法可能过于敏感，有报道无论临床有无症状缓解，都可以持续阳性[9]。因此，依赖组织PCR诊断CMV病，特别需要结合临床表现，谨慎评估[22]。大便DNA检测方法近年来提出[16,20]，最大的优点是无创，但报道较少，确定的效果还需要进一步评估。

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